GB/T 27405－2026《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　食品微生物檢測(cè)》已于今年3月1日正式實(shí)施。由于涉及食品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的管理、運(yùn)作、能力評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制等方面要求，因此該標(biāo)準(zhǔn)的頒布和實(shí)施備受關(guān)注。

        新舊標(biāo)準(zhǔn)中涉及定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)定的條款如下：

        可以看出，2008版要求每個(gè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)都應(yīng)有評(píng)定測(cè)量不確定度的程序，同時(shí)也認(rèn)識(shí)到微生物評(píng)定不確定度有很大難度，所以對(duì)于評(píng)定測(cè)量不確定度沒有更詳細(xì)的要求。但是2026版就明確要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分別進(jìn)行定量（平板計(jì)數(shù)法）、半定量（MPN法）微生物檢測(cè)方法的不確定度評(píng)估。 

  在推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)RB/T 228－2023《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》中，測(cè)量不確定度有三種不同類型的分量，分別是技術(shù)不確定度、基質(zhì)不確定度和分布不確定度。測(cè)量不確定度評(píng)定的框架結(jié)構(gòu)，如下圖所示。其中定量（平板計(jì)數(shù)法）和半定量（MPN法）微生物檢測(cè)方法的不確定度評(píng)估同時(shí)涉及上述三種分量。

        其中技術(shù)不確定度是最重要的，也是大家最熟悉的，在RB/T 228-2023的前身RB/T 151-2016《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》中就有描述，只是直接用具體參數(shù)表示，即實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差。基質(zhì)不確定度是考慮食品基質(zhì)中微生物分布的影響，采用重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差來計(jì)算，有些基質(zhì)可直接用定值，所以并不困難。而分布不確定度與檢測(cè)方法關(guān)系密切，且屬于新增分量，所以本文重點(diǎn)介紹分布不確定度。分布不確定度，是指微生物在實(shí)驗(yàn)室樣品、起始稀釋樣品勻液和隨后的梯度稀釋過程中分布不均產(chǎn)生的不確定度，類型取決于所使用的檢測(cè)方法。平板計(jì)數(shù)法又根據(jù)是否需要進(jìn)行下一步的驗(yàn)證而細(xì)分為泊松不確定度和確證不確定度，此兩者為遞進(jìn)關(guān)系，不是平行關(guān)系。

測(cè)量不確定度各分量框架圖

        例如菌落總數(shù)測(cè)定，PCA計(jì)數(shù)后沒有進(jìn)一步需要確證的步驟，因此只涉及泊松不確定度。而大腸菌群平板法，VRBA計(jì)數(shù)后，還需要BGLB進(jìn)行驗(yàn)證，因此涉及兩個(gè)不確定度，即VRBA過程中的泊松不確定度和BGLB驗(yàn)證時(shí)產(chǎn)生的確證不確定度。關(guān)系明確后，我們對(duì)這三個(gè)不確定度進(jìn)行簡單介紹。

第一 泊松不確定度（μ_poisson）

        假設(shè)微生物在接種液中隨機(jī)分布符合泊松分布模型而產(chǎn)生的不確定度。此不確定度在計(jì)算時(shí)，只與平板上的菌落數(shù)有關(guān)。通常檢驗(yàn)過程中一般做2～3個(gè)適宜稀釋度，最終結(jié)果報(bào)告時(shí)，根據(jù)平板上菌落數(shù)，選擇其中一個(gè)或兩個(gè)稀釋度的菌落數(shù)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。泊松不確定度計(jì)算用的菌落數(shù)就是我們計(jì)算樣品結(jié)果時(shí)選擇的稀釋度平板上菌落數(shù)的和，即∑C。當(dāng)1≤∑C≤40時(shí)，可直接查表得出泊松不確定度，當(dāng)∑C＞40CFU時(shí)，則需要帶入公式計(jì)算泊松不確定度。圖表和公式如下：

        例1：某檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，100倍稀釋結(jié)果分別為75 CFU和83 CFU，10倍和1000倍稀釋計(jì)數(shù)結(jié)果不在30 CFU～300 CFU的范圍，因此直接選用100倍稀釋度上平板菌落數(shù)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。那么此結(jié)果的泊松不確定度計(jì)算如下：

        因158＞40，無法查表，需帶入公式計(jì)算：

        經(jīng)計(jì)算后，此次菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果的泊松不確定度為0.0346。

第二 確證不確定度（μ_conf）

        在挑菌落驗(yàn)證時(shí)，假設(shè)菌落為均勻分布，使用二項(xiàng)分布來計(jì)算某一特定結(jié)果而產(chǎn)生的不確定度。此不確定度在計(jì)算時(shí)，只與挑菌落驗(yàn)證數(shù)和驗(yàn)證后的陽性菌落數(shù)有關(guān)，即疑似菌落數(shù)（n_p）和被確證為目標(biāo)菌數(shù)（n_c）。計(jì)算方法依然是查表和公式兩種，一般情況下，查表可以滿足要求。具體如下：

        例2：某檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展大腸菌群平板法檢測(cè)，100倍稀釋度分別為75 CFU和83 CFU，10倍和1000倍稀釋計(jì)數(shù)結(jié)果不在15 CFU～150 CFU的范圍。在100倍稀釋度的2塊平板上，各挑取5個(gè)典型和可疑菌落進(jìn)行BGLB驗(yàn)證，驗(yàn)證陽性結(jié)果是4/5和2/5。

        此實(shí)驗(yàn)的泊松不確定度計(jì)算和結(jié)果同例1一樣，不再贅述，泊松不確定度為0.0346。

        確證不確定度計(jì)算中，n_c為6，n_p為10，因此直接查表可知，確證不確定度為0.1027。

第三 最可能數(shù)不確定度（μ_MPN）

        基于多次檢出或未檢出結(jié)果組合的最大似然估計(jì)得到最可能數(shù)（MPN）而產(chǎn)生的不確定度。此不確定度在計(jì)算時(shí)，只與實(shí)驗(yàn)中接種總管數(shù)和陽性管數(shù)相關(guān)，與所選擇的樣品稀釋度無關(guān)。對(duì)于需要對(duì)疑似陽性結(jié)果進(jìn)行確證的MPN法，在計(jì)算MPN值及不確定度時(shí)宜基于已確證的陽性結(jié)果數(shù)，即MPN值和μ_MPN取決于確證后的陽性結(jié)果數(shù)。計(jì)算方法是查表，表格部分截圖如下：

        例3：某檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展大腸菌群MPN法計(jì)數(shù)，LST結(jié)果為3-2-1，經(jīng)BGLB驗(yàn)證后結(jié)果為2-1-1。最可能數(shù)不確定度計(jì)算時(shí)，以BGLB驗(yàn)證后的結(jié)果為準(zhǔn)，查表可知此實(shí)驗(yàn)的最可能不確定度為0.23。

        以上就是對(duì)三種分布不確定度的簡單介紹。測(cè)量不確定度評(píng)估的內(nèi)容還很多，比如合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度、測(cè)量不確定度的表示方法和單位等內(nèi)容，本文就不一一展開，大家可自行參看RB/T 228－2023《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》。

        感謝大家對(duì)北京陸橋一如既往的支持！

參考文獻(xiàn)：

1. RB/T 228－2023《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》

2. GB/T 27405－2026《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　食品微生物檢測(cè)》

3. GB/T 27405－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　食品微生物檢測(cè)》